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腺相关病毒AAV生产流程

第一步:基因克隆。将外源基因克隆进入Vigenebio公司的人源或shRNA腺相关病毒载体,pAV-FH AAV等载体的多克隆位点与我们的human ORF穿梭克隆相兼容,非常适于哺乳动物ORF的表达。

第二步:细胞转染。将携带外源基因的重组质粒与辅助质粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector共转染进入HEK293T细胞,感染72h之后即包装完毕。

第三步:收毒。分别收获培养基上清与细胞沉淀,PEG8000沉淀培养基上清中的病毒,培养基上清先用0.45um滤膜过滤。

第四步:病毒纯化。通过碘克沙醇法对病毒进行纯化,一方面提高病毒滴度,另一方面某些动物实验需要纯化之后才可进行。

第五步:滴度检测。用QPCR的方法来检测病毒的滴度,得到的结果为包装得到的病毒颗粒数。

Vigenebio的pAV-FH AAV载体,具有Amp抗性、CMV启动子,带有Flag-His标签。多克隆位点与Vigenebio的human ORF穿梭克隆相兼容。非常适于哺乳动物ORF的表达。Vigenebio为您提供了多种表达shRNA的rAAV,包括U6或H1启动子和作为哺乳动物表达标记的GFP或RFP。同时,也可根据您感兴趣的基因提供shRNA设计服务。

pAAV-rep/cap质粒(图)包含AAV编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因,获得期望的高滴度病毒产品的关键基因。

 

pHelper 质粒(图)包含AAV-HEK293T 生产高滴度病毒必须的的腺病毒基因VA,E2A 和E4 的集合。提供AAV 生产所必需的腺病毒蛋白质E1A 和E1B 在HEK293T 细胞中稳定表达。

 

生产流程示意图

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