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腺相关病毒AAV在动物实验中的应用(AAV in vivo cell labeling)

 

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),作为一种将外源基因转入动物组织和细胞的病毒载体已越来越多地为生物科学研究人员应用于广泛地动物体内研究中。虽然很多实验室都建立了独特的腺相关病毒动物体内注射方法,很多刚刚接触腺相关病毒的研究人员仍不是很清楚如何注射,应当注射多少病毒,注射的部位如何选择,注射动物,特别是小鼠的发育时间的选择,在注射后什么时间去检测等等。由于研究领域的不同,研究的动物不同,腺相关病毒的动物注射很难有较简单并且可以广泛使用的方法。我们试图通过几种常见的方法为大家提供一个基本概念。具体科研实验还需每个研究人员具体摸索。

一. 腺相关病毒的生产,纯化和保存 

腺相关病毒一般是利用表达质粒在HEK293细胞中表达病毒蛋白和带有外源基因的病毒基因组,并在细胞内组装而产生的。在HEK293细胞中产生的粗病毒是不可以用于动物体内注射的。其原因有这样几点,1. 粗病毒中带有大量的细胞蛋白和DNA,这些杂质在进入动物体内时会造成动物较强的免疫反应,这样的病毒得到的结果是不可信的;2. 在病毒生产过程中会产生大量的不带有病毒基因组的所谓空病毒,这些病毒进入动物后会竞争,阻断有效病毒与细胞的结合,从而降低病毒的侵染效果;3.粗病毒中的有效病毒滴度低,且易于细胞污染蛋白结合,所以达不到注射后需要看到有效反应的病毒量。目前常用的腺相关病毒纯化方式有氯化铯密度梯度离心,肝素亲和柱,离子交换柱,和最新的碘克沙醇梯度离心等。纯化后的病毒需进一步透析去除离心介质,并浓缩到较小的体积和较高的滴度。通常纯化浓缩后病毒滴度达到10^12CG/Ml时就可以用于大多数动物体内注射研究了。

腺相关病毒物理稳定性很好,病毒经分装后在磷酸盐缓冲液中,放置在-80度可以长期保存。几年内病毒不会有感染活性和滴度的明显下降。

 

二.目前腺相关病毒主要用于的研究

目前腺相关病毒在动物实验中的主要应用有一些几个方面: 一是对某些细胞的特异性荧光标记;二是对神经系统某些投射路径的标记;三是基因过表达或基因表达抑制;四是在Cre转基因小鼠中, 对于特定细胞的标记,基因过表达或基因表达的抑制。此处我们结合Ji-yoen Kim 发表的结果先介绍下AAV病毒用于荧光蛋白基因的初生小鼠的大脑注射以帮助了解如何利用AAV来在动物体内做细胞标记。

(一)对某些细胞特异性的荧光标记(Fluorescent labeling of cell populations)

   通过标记动物体内少数细胞并改变他们的基因信息,从而能在野生型的背景上研究动物体内这些变异细胞的功能,这一方法称为镶嵌动物模型(mosaic animal models)。比如,通过在小鼠体内嵌合表达荧光蛋白,就是研究体内神经细胞的形态的有力工具。然而,目前常用的方法,如子宫内电击转染技术(In Utero Electroporation, IUE)、原核注射等遗传操作技术以及转座酶介导的重组等都存在极大的局限性。近期,一种向新生小鼠脑室中注射重组AAV的方法表现出前所未有的优势。这种方法不仅操作简单,而且能够产生迅速而持久的荧光标记。最重要的是,可对整个大脑中的神经元实现广泛的转导,并对大脑中的细胞群体进行特异性标记。此法最初由John Wolfe提出,并由Ji-Yoen Kim等人完善。我们在此就根据他们发表的论文对这一技术进行一些简介,主要内容和结果均来自他们发表的Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo

1、简单、安全的侧脑室注射法

进行重组AAV注射时,精确靶向侧脑室可使得脑损伤降到最小。选取出生后6小时的P0小鼠,精确定位两个侧脑室注射点——一个插入点是位于λ与眼睛之间的假想线的2 / 5处(近λ);另一个点是位于λ和前囱点连线的中点,距离矢状缝1mm处(Fig 1A & 1B)。将注射针垂直插入头骨表面深3mm处,把总体积为2μL的重组AAV、PBS和0.05%的台盼蓝染液推入。准确注射后,应观察到从嗅球到小脑之间连贯整个大脑脑室的染色。在喙纹状体部位的大脑横切面应显示染料填充整个脑室且限制在脑室内(Fig 1D)。值得注意的是,选择合适大小的针头既能够避免组织损伤,又能防止针头堵塞。利用此AAV侧脑室注射法可得到大于95%的小鼠生存率和较为一致的感染模型,且不会出现组织损伤。

Table

 

Figure 1. Intracranial injection of adeno-associated virus into the cerebral lateral ventricles of neonatal mice.

2、   重组AAV侧脑室注射拥有出色的荧光标记效果

将eYFP或tdTomato重组到AAV8中注射到P0小鼠侧脑室,3至4周后观察到新生小鼠大脑被AAV广泛感染。其中,嗅球、纹状体、大脑皮质、海马区和小脑出现密集的荧光标记(Fig2A-H)。同时,上下丘、延桥、脑髓中也存在荧光标记,并且从脑髓液中扩散到第四脑室及蛛网膜下腔(Fig 2G & 2H)。而成年小鼠侧脑室注射只引起注射部位周围的有限感染(Fig 2I,J vs 2K,L)。不仅如此,P0小鼠行AAV侧脑室注射12个月后,荧光分布依然同注射后3周时保持在相同组织结构中,并维持相似的荧光强度。

重要的是,新生小鼠注射后未出现发育畸形。P0注射AAV的小鼠的大脑区域都呈现正常的形态和神经解剖学结果,甚至通过免疫组化染色星形胶质细胞和小神经胶质细胞,发现形态与未注射的野生型一致。同时,也没有小鼠表现出明显的行为异常。

 

Figure 2. Neonatal intraventricular AAV injection produces widespread and long-lasting
transgene expression in the brain.

AAV注射后基因表达出现的时间是很快的。在P0注射EF1-α启动编码tdToma基因,两天后就可以检测到tdTomat在大脑中的广泛表达,表达强度在一周内持续增加,到了出生后第7天可达到注射后6-12个月的荧光强度。AAV侧脑室注射后的基因表达呈现出意想不到的速度,这也给研究新生小鼠早期脑发育提供了功能强大的新工具。

3、 重组AAV侧脑室注射具有灵活的可调控性

重组AAV侧脑室注射这一方法还具有更个性化的选择可能。不同的AAV血清型、启动子、注射时间以及病毒滴度皆可产生不同的组织嗜性、细胞特异性和感染效率,遂可根据实际研究目的来选择合适的实验条件。

   3.1 重组AAV的血清型和启动子可调节病毒基因表达的区域

通过比较AAV1、AAV6和AAV8发现,血清型不同的AAV在侧脑室注射以后会对特定神经元和细胞类型产生偏好性(Table 2)。总体来说,AAV1和AAV6更倾向于感染无须进入软组织就可到达的脑室室管膜细胞层。其中,AAV1在新皮层的浅层区域、嗅球和尾大脑皮层呈现密集表达。然而,相比AAV1和AAV8来说,注射AAV6后荧光表达较为稀疏,主要集中在腹侧小脑小叶VIII、 IX和 X (Fig 4)。基因的表达速度并没有因AAV血清型的改变而发生变化,与注射重组AAV8相同,注射重组AAV1和重组AAV6都在P2时即呈现明显荧光标记 。

Table 2

                 

Table 3

 

当在重组AAV8中使用不同的启动子时发现,使用CBA(Chick  βactin)启动子的AAV8-CBA和使用EF1α(Elongation factor 1 α)启动子的AAV8-EF1α在整体转导区域上基本一致。值得注意的是,与AAV8-CBA相比,AAV8-EF1α基因表达更快达到饱和,且更倾向于转导小脑浦肯野细胞;而AAV8-CBA在新皮层中的表达更均匀一致(Table 3)。

尽管不同血清型的重组AAV和不同类型的启动子能够影响病毒基因表达的区域,但通过NeuN标记神经元发现,它们的共同点是特异标记大脑中的神经细胞。

 

            Figure 4. Both serotype and promoter influence the onset and pattern of transgene expression.

3.2 重组AAV注射时间可调控病毒感染的效率及细胞类型

分别在P0、P1、P2或P3将滴度为2.0×109VP的AAV8注射到同窝出生的小鼠侧脑室中,4周之后观察转基因情况。发现P1与P0注射没有明显差别,而P2或P3的AAV延迟注射导致大脑结构远侧部位病毒表达减少,如大脑皮层浅层区域、嗅球、小脑等(Fig 5A、C、E)。不仅如此,通过Iba1和S100β标记小胶质细胞和星形胶质细胞发现,延迟注射时间还使得在除了嗅球以外的大部分区域出现大量被标记的非神经细胞(Fig 5B、D、F),且主要是星形胶质细胞。

脑室内注射AAV8的时间能够显著影响整体转导水平,同时提供了一种特异标记星形胶质细胞的新方法(Fig 5 G-L)。

Table 4

     

Figure 5. Timing of AAV8 injection alters the pattern and cell-specificity of transduction. 

3.3重组AAV滴度可调控转基因嵌合程度

使用病毒介导转基因的优势之一就是可以通过调整病毒滴度来改变转导效率。

把AAV8-YFP和AAV1-YFP稀释至1010VP/μL到108VP/μL,将2μL病毒分别注射至P0小鼠侧脑室。整体上看,可发现大脑中荧光标记的强度随病毒滴度的降低呈现明显减弱,AAV1荧光减弱程度更(Fig 6A)。其中,AAV8滴度的降低并不影响荧光分布的区域,仍旧对整个大脑的神经元进行转导;而AAV1滴度的降低使得病毒对脉络丛呈现极高的亲和性(Fig 6B)。

通过优化病毒滴度,可以构建两种研究模型。一种是通过注射高滴度的AAV,构建许多转基因神经元包围个别野生型神经元的模型,进而可以进行病毒转导对细胞外影响的相关研究;另一种是通过注射较低滴度的AAV,构建个别转基因神经元模型,进行病毒转导对细胞内影响的相关研究(Fig 6C)。

 

Figure 6. AAV8 offers a broad dynamic range for mosaicism.

如Ji-Yoen Kim,John Wolfe等人的工作所显示的,在小鼠出生后不久,利用AAV侧脑室注射表达的荧光蛋白的方法具有可以标记各种神经细胞和神经胶质细胞。对于AAV血清型, 启动子,注射时间,和注射量的控制,就可以根据实验的需要标记不同的细胞,不同数目的细胞。既可以在野生型的背景上研究少数带有外源基因的细胞,且可以在改变了基因的背景上研究野生型的细胞。由于AAV的高侵染性,表达出现迅速,且表达时间长,这个方法的建立,可以极大地推动从动物神经细胞,组织发育,神经网络的建立,到神经细胞功能联络等多方面的研究。

 

维真生物在国内建立起了多方面的AAV病毒的克隆,包装和纯化服务。我们提供目前常见的AAV的所有血清型的病毒包装和纯化。并提供数十种不同的组织和血清特异性的启动子。我们包装和纯化的AAV9型的神经细胞特异启动子的GFPAAV病毒在用类似的方法注射到小鼠神经系统后可以特异地标记多种神经细胞,包括大脑皮层,海马区的神经细胞和脊椎腹角及背角的运动和感觉神经元细胞。

 

 

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