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腺相关病毒AAV光遗传学技术

光遗传学(optogenetics)又称光刺激基因工程(optical stimulation plus genetic engineering),是一种通过光学和遗传学技术在活体动物脑内精准控制细胞行为的技术。由于其高度的时空特异性,光遗传技术广泛应用于神经科学领域的研究。

2010年,光遗传学技术荣膺Nature Methods 年度生命科学技术。 2010年,被Science认为是近十年的突破之一。 光遗传学技术再次被Nature Methods评为2016年最值得关注的八项技术之一。 未来,光遗传技术将对神经及精神领域疾病的治疗及神经科学以外的组织功能研究贡献更多力量。

一. 光遗传学之前

1979年,Francis Crick提出,神经科学领域急需开发出一种控制技术,进而在不改变其它条件的情况下对大脑里的某种细胞进行操控。由于电刺激信号(electrode)无法对细胞进行精确的定位刺激,而化学药物起效速度慢,无法精确定时控制,于是Crick考虑是否可以利用光控技术。虽然微生物学家们早已发现一些可以表达可见光敏蛋白(visible light-gated protein),但当时还没人将此联系在一起。

光遗传学出现之前神经科学领域的主要研究技术

  图1. 光遗传学出现之前神经科学领域的主要研究技术

二.光遗传学

1.光遗传学的发展历程

2005年8月Karl Deisseroth实验室发表的一篇文章为神经领域的科学家们带来了一项期待已久的新技术——光遗传学技术。这项技术的实现基于单组分控制工具——光敏蛋白的发现。

光遗传学的发展历程

图2. 光遗传学的发展历程

2.光遗传学原理

在神经元细胞中,细胞膜去极化后会出现动作电位。反之,细胞膜超极化则会抑制峰电位的出现。在神经元细胞中表达可以改变膜电位的外源性光敏蛋白编码基因,就能够通过光控操作来控制峰电位开关。

神经元的静息电位和动作电位

 图3. 神经元的静息电位和动作电位

这类微生物编码的视蛋白神经元细胞开关中第一个被使用的就是ChR2(channelrhodopsin-2)。作为一种非选择性阳离子通道蛋白,在神经元中表达的ChR2在蓝光照射下会立即使神经元发生去极化反应,诱发动作电位。

不过,科学家不总是想要激活神经元细胞。有一种名为NpHR的试验菌视紫红质蛋白(halorhodopsin)是一种氯离子泵,它所在的神经元细胞被黄光照射之后会发生超级化反应,抑制动作电位的形成。

调控膜电位的光遗传学工具——光敏通道蛋白

图4. 调控膜电位的光遗传学工具——光敏通道蛋白
(Erika Pastrana,2011)

3. 光遗传学所需的辅助技术及基本步骤

光遗传学技术包括的范围是广泛的。主要包括以下几种。

光遗传学技术及其辅助技术

图5. 光遗传学技术及其辅助技术

在光遗传操作中,细胞会表达特定的编码光敏蛋白的基因,然后使用光来改变细胞的行为。光遗传学控制细胞功能的基本步骤如下:

光遗传学控制细胞功能的基本步骤

 图6. 光遗传学控制细胞功能的基本步骤

 其中,通过病毒感染将外源光敏蛋白的遗传信息传递给靶细胞的方法是最方便快捷的。得益于腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)对大脑特异的组织嗜性,使得AAV成为光遗传研究中的重要工具。

4. 光遗传学技术的优势——高时空分辨率

光遗传学技术在根本上解决了如何精确调控细胞行为的问题。这基于其具有高度时空特异性的优势。光遗传学技术在时间上控制精度可达毫秒(ms)级别,空间精度可达单个细胞级别,是电信号刺激和化学药物所无法比拟的。

光遗传学的高时空分辨率

图7. 光遗传学的高时空分辨率

三、ViGene为您提供超多选择的AAV光敏通道蛋白载体

特定的启动子和特定的AAV血清型,将为您的光敏遗传实验提供更精准的空间定位。ViGene为您提供24种启动子、7种AAV血清型和5中光敏通道蛋白,超过840种载体组合。除此之外,还可根据您的需求定制光敏载体质粒。

超多选择成就您个性化的实验需求!

 ViGene提供的AAV血清型

表1. ViGene提供的AAV血清型

Cat.#

Promoter Name

Size

Description

Download

AP10001

ALB

2.4kb

Liver specific 10 timer stronger than CMV after 10 weeks

Vector Sequence

AP10002

GFAP104

845bp

Hybrid of EF1a and GFAP

Vector Sequence

AP10003

CAG

944bp

Strong promoter, ubiquitous expression in vivo

Vector Sequence

AP10004

CamKIIa

1.2kb

Specific expression in excitatory neurons in the neocortex and hippocampus

Vector Sequence

AP10005

EF1A

1.2kb

Ubiquitous, weaker than CMV but better for in vivo

Vector Sequence

AP10006

CK1.3

1.1kb

 

Vector Sequence

AP10007

CK0.4

217bp

Calcium/Calmodulin-dependent kinase II alpha

Vector Sequence

AP10008

GFAP

1.0kb

Specific in astrocyte

Vector Sequence

AP10009

MBP

1.3kb

Myelin basic protein promoter, efficient transduction of oligodendrocytes by adeno-associated virus type 8 vectors

Vector Sequence

AP10010

EFFS

253bp

A short version EF1A

Vector Sequence

AP10011

TBG

460bp

Homo sapiens serpin peptidase inhibitor, clade A

Vector Sequence

AP10012

aMHC

0.4kb

Mouse myosin heavy chain alpha promoter

Vector Sequence

AP10013

cTNT

702bp

Specifically transduce cardiomyocytes

Vector Sequence

AP10014

Synapsin

471bp

Specific in neuron

Vector Sequence

AP10015

Mecp2

230bp

Truncated Mcep2 neuron specific

Vector Sequence

AP10016

c-fos

1.7kb

Activity-dependent promoter

Vector Sequence

AP10017

ApoE/AAT1

1.4kb

Chimeric promoter of human alpha-1-antitrypsin and cer/hepatic locus control region (HCR). Liver specific.

Vector Sequence

AP10018

UBC

1.1kb

Ubiquitous, weaker than CMV but better for in vivo

Vector Sequence

AP10019

PGK

400bp

Ubiquitous, weaker than CMV but better for in vivo

Vector Sequence

AP10020

Somatostat

1.2kb

Restricting expression to GABAergic neuron

Vector Sequence

AP10021

Rpe65

700bb

Retinal Pigment epithelium-specific expression in vivo and in vitro

Vector Sequence

AP10022

Insulin1

1.0kb

Specific in beta- cells of the pancreas

Vector Sequence

AP10023

3Xenhancer McK

728bp

Much stronger than CMV in muscle, inactive in nonmuscle cell lines and mouse liver

Vector Sequence

AP10024

NSE

1.3kb

Neuron-specific enolase promoter

Vector Sequence

表2. ViGene提供的启动子类型

ViGene提供的光敏通道蛋白类型

表3.ViGene提供的光敏通道蛋白类型

表4:ViGene部分光遗传现货

 

附:光遗传技术相关文献

1. 激活型光敏通道蛋白的应用

   

2015年,Dheeraj Pelluru等发表在European Journal of Neuroscience上题为Optogenetic stimulation of astrocytes in the posterior hypothalamus increases sleep at night in C57BL/6J mice的文章中发现,在睡眠-觉醒周期的活动期刺激下丘脑后的星形胶质细胞会引起睡眠,从而揭示了星形胶质细胞在睡眠-觉醒调控中的重要作用。

AAV5将ChR2-EYFP特异表达在星形胶质细胞

附图1. 通过AAV5将ChR2-EYFP特异表达在星形胶质细胞中。(Dheeraj Pelluru,2015)

星形胶质细胞使用不同的光刺激频率对睡眠

附图2.向星形胶质细胞使用不同的光刺激频率对睡眠的影响。在关灯后的前6个小时,
利用光遗传学技术使用不同频率的蓝色光(473nm,10ms)激活星形胶质细胞,分别
记录觉醒、非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠的时间。发现使用10Hz刺激表达ChR2的星形
胶质细胞时,能够显著提高非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠的时间,并相应减少觉醒时间。
(Dheeraj Pelluru,2015)

 

星形胶质细胞使用不同的光刺激时间对睡眠的影响

附图3.向星形胶质细胞使用不同的光刺激时间对睡眠的影响。在关灯后的第12个小时开始,
利用光遗传学技术使用不同频率的蓝色光(473nm,10ms)激活星形胶质细胞,激活1min,
暂停4min,持续6小时,分别记录觉醒、非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠的时间。发现不同时
间的刺激对觉醒时间和非快速眼动睡眠时间产生显著影响,并在关灯后第15个小时达到顶峰。
(Dheeraj Pelluru,2015)

2. 抑制型光敏通道蛋白的应用

 2013年,Michael T. Stefanik等发表在Front Behav Neurosci上题为Optogenetic dissection of basolateral amygdala projections during cue-induced reinstatement of cocaine seeking的文章中发现,通过抑制杏仁核神经元从而投射到伏隔核中央核和前额叶,能够降低大鼠恢复可卡因寻求的可能。

AAV2将ArchT特异表达于杏仁核基地外侧核

附图4. 通过AAV2将ArchT特异表达于杏仁核基地外侧核中,发现通过光照抑制神经元活动,可降低寻求可卡因
行为恢复的可能。(A)通过561nm光照抑制杏仁核神经元,能显著降低大鼠主动压杆次数;(B)DAB染色显示
在杏仁核神经元中过表达的ArchT-GFP;(C)通过光照抑制杏仁核神经元获得的降低寻求可卡因的效果,明显优
于没有接受光照的效果,且接近消减给药获得的效果;(D)光照只带有GFP的AAV2感染的杏仁核神经元对实验无影响。
(Michael T. Stefanik,2013)

抑制杏仁核神经元对伏隔核中央核的神经元的投射,可降低寻求可卡因行为恢复的可能

附图5. 通过抑制杏仁核神经元对伏隔核中央核的神经元的投射,可降低寻求可卡因行为恢复的可能。
(A)通过561nm光照抑制伏隔核中央核神经元,能显著降低大鼠主动压杆次数;(B)DAB染色显示在
伏隔核中央核区域中ArchT-GFP呈现高表达;(C)通过光照抑制伏隔核中央核获得的降低寻求可卡因的
效果,明显优于没有接受光照的效果,且接近消减给药获得的效果。(Michael T. Stefanik,2013)

通过抑制杏仁核神经元对前额叶神经元的投射,可降低寻求可卡因行为恢复的可能。

附图6. 通过抑制杏仁核神经元对前额叶神经元的投射,可降低寻求可卡因行为恢复的可能。
(A)通过561nm光照抑制前额叶神经元,能显著降低大鼠主动压杆次数;(B)DAB染色显示
在前额叶区域中ArchT-GFP呈现高表达;(C)通过光照抑制前额叶区域获得的降低寻求可卡因
的效果,明显优于没有接受光照的效果,且接近消减给药获得的效果。
(Michael T. Stefanik,2013)

AAV注射杏仁核后光纤终端的位置示意图

附图7. 实验中光纤终端的位置示意图。数字指示距离前囱点冠状断面处的毫米数(mm)。
(A)AAV注射杏仁核后,位于杏仁核的光纤终端位置;(B)AAV注射杏仁核后,位于伏隔
核中央核的光纤终端位置;(C)AAV注射杏仁核后,位于前额叶的光纤终端位置。
(Michael T. Stefanik,2013)

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